Oriscience  Annexin V-Alexa Fluor 488/PI Apoptosis Detection Kit（Annexin V-Alexa Fluor 488/PI 细胞凋亡检测试剂盒）提供了一种快速、方便的检测细胞凋亡的方法，可通过流式细胞仪或荧光显微镜进行检测。Annexin V是一种钙离子依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸（PS）有高度亲和力，在正常生理条件下，PS主要位于质膜的内叶。在启动细胞凋亡时，PS被转移到细胞外膜上。PS一旦到达膜外，即可被Annexin V-Alexa Fluor 488结合，从而检测出细胞的凋亡。相对于FITC，Alexa Fluor 488的稳定性更好，在较宽的pH范围内（pH 4-10）保持相对稳定。碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)可与双链DNA特异性结合，并产生强烈的荧光，正常情况下无法透过细胞膜，由于凋亡晚期或坏死细胞膜完整性丧失，PI可进入细胞内对DNA进行染色，与Annexin V搭配使用，可区分处于不同凋亡时期的细胞。 

本试剂盒可用于流式细胞仪、荧光显微镜进行检测。

储存条件

4℃避光保存， Annexin V-Alexa Fluor 488不可冷冻。

数据展示

用PLK抑制剂(Volasertib，BI6727)诱导A549细胞(人非小细胞肺癌细胞)凋亡，诱导浓度分别为0μM（A）、1.8 μM（B）、9 μM（C），分别诱导24 h后，根据说明书实验方案进行染色，用流式细胞仪检测结果如下图。随着药物浓度的增加，凋亡细胞明显增加，说明Annexin V-Alexa Fluor 488/PI 细胞凋亡检测试剂盒的分离效果佳。

注意事项

1. 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

2. 被Annexin V染色的细胞不能用多聚甲醛或甲醇等试剂固定或透化；不能有破坏细胞膜的操作，因为这可能会产生假阳性。

3. 胰酶消化后，可在培养基中于最佳培养条件下恢复约30 min后染色，避免假阳性。

4. 在样品采集前加入PI，因为长时间与PI孵育可能会导致假阳性结果。

5. 由于检测细胞种类、诱导剂类型、仪器型号的差异，可选择设置加入不同的Annexin V-Alexa Fluor 488用量（如：1.5 μL、3 μL、6 μL），通过流式分析获取检测时Annexin V-Alexa Fluor 488的最佳用量，以取得更好的实验结果。

6. 染色后需尽快检测，时间过长会导致凋亡和坏死的细胞增加。

7. 神经细胞膜容易破坏外翻，导致假阳性，不适合此方法检测。

8. 如果样品来源于血液，请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS，能与Annexin V结合，从而干扰实验结果。可以使用含有EDTA的缓冲剂并低速离心（200×g）洗去血小板，然后用Binding Buffer清洗细胞，以避免残留的EDTA会螯合Ca²⁺。

9. 1×Annexin V Binding Buffer的瓶盖要紧闭，防止空气中的CO₂进入后形成碳酸钙沉淀，减少游离Ca²⁺， 导致实验失败。

10. PI染料有毒，为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

11. 试剂在使用前可短暂离心，防止溶液粘在管壁。

12. 本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗，食品及化妆品等用途。

Q1：流式细胞仪检测细胞凋亡，贴壁细胞有无更好的消化方式？

a. 检测消化时间不易控制的贴壁细胞，建议用对细胞损伤小且不会影响细胞膜上PS分布的Accutase细胞消化液。

Q2：是否可以用PBS代替凋亡试剂盒里面的Annexin V Binding Buffer？

a. 不可以，Annexin V与PS的结合依赖Ca²⁺，Annexin V Binding Buffer含有Ca²⁺，能促进Annexin V与PS的结合。不加Annexin V Binding Buffer，会导致Annexin V的结合能力降低，造成阳性信号下降甚至无阳性信号。

Q3: 没有检测到Annexin V-Alexa Fluor 488信号？

1. 可能细胞没有凋亡，没有PS外翻，可用显微镜观察，验证细胞的形态；也可能是Annexin V Binding Buffer的pH降低，检查结合液的pH，确保其pH ＞5，最佳pH=7.2。